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微生物修复石油烃污染土壤研究进展
杨 博1，2 ，李娜娜1，2，陈景辉2，于 恒1，2，屈撑囤1，3，杨鹏辉1，2，李荣华4，何 炽5
(1.西安石油大学 化学化工学院，陕西 西安 710065； 2.西安石油大学 陕西省油气田环境污染控制技术与储层保护 重点实验室，陕西 西安 710065； 3.石油石化污染物控制与处理国家重点实验室，北京 102206； 4.西北农林科技大学 资源环境学院，陕西 杨凌 712100； 5.西安交通大学 动力工程多相流国家重点实验室，陕西 西安 710049)
摘要：石油烃污染会恶化土壤环境，严重危害土壤生态系统，在其修复技术中，生物修复技术具有修复彻底、无二次污染等优势。本文系统介绍了石油烃污染土壤修复技术的发展历程，并通过调研国内外微生物修复机理、影响因素、菌种构成及耦合方式等方面的研究成果，总结分析了微生物修复石油烃污染土壤技术的特点，最后结合政策、法规及标准等导向性因素对石油烃污染土壤微生物修复技术研究的发展方向进行了展望。
关键词：石油烃污染；土壤修复技术；微生物；耦合技术
引 言
石油烃类物质包括饱和烃、芳香烃、胶质和沥青质等，具有黏着力强、含碳量高、有机物种类多及难降解等特点[1]，属于《国家危险废物名录》(2021年版)中的HW08类危险废物。石油工业全产业链(勘探、开发、储运及炼化等)均伴随着石油烃污染问题。该类污染物质进入土壤后，会使土壤通透性减弱、肥力下降，严重影响土壤结构和理化性质，并可能通过食物链危害人体健康[2]。20世纪80年代以前，石油烃污染土壤修复主要采用物理和化学修复技术。其中物理修复技术主要包括填埋[3]、气相抽提[4]、超声清洗[5]、电动修复[6]等。化学修复技术主要包括化学淋洗[7]、热分解[8]、化学氧化[9]、光催化[10]等。物理和化学修复效果好、效率高，因此应用较为广泛，但是对其引发的土壤结构、生态和理化性质破坏的问题在当时并未引起足够重视[11]。关于生物修复技术，早在20世纪50年代就在包括生长条件、菌种、氧化反应机理以及催化氧化产物等方面开展了较为系统的研究[12]。1989年，埃克森·瓦尔迪兹(Exxon Valdez)号油轮石油泄露事件(又称阿拉斯加港湾漏油事件)爆发后，生物修复石油烃污染技术因其出众的降解能力(降解了泄漏原油污染总量的50%，接近物理和化学方法总和的4倍)及应用成本低、环境破坏性小且无二次污染等特点而广受关注，自此该技术的发展迎来了历史性转折点[11-18]。
生物修复包括植物、动物和微生物修复。植物修复主要是通过植物的吸收、固定、挥发、超积累及根际降解[19-20]等途径使土壤环境得到净化的技术。其中根际降解效果最为突出，即植物通过根系分泌物改善土壤环境，为微生物提供适宜的栖息地，从而提升污染物降解率[21-25]。此外，植物根茎叶等残体也可以作为石油烃污染土壤的刺激物和土壤调理剂，将污染土壤做植物凋落物处理后，能够明显降低石油污染物毒性，并且促进土壤中放线菌类群和真菌的增殖[26]。动物修复是利用土壤中动物(如蚯蚓、线虫等)的被动扩散和摄食作用富集去除土壤污染物的修复技术[27]，且土壤动物也被用于土壤毒害诊断和风险评价[28-29]。其中，蚯蚓不仅能以表皮接触扩散和摄食作用的方式直接去除部分有机化合物[30]，还可以通过改良土壤环境、刺激土壤酶活性等方式[31]促进污染物降解，因此相关研究较多。植物和动物修复技术具有易投放、寿命短、增殖快和适应力强等共性特点，但修复周期多以年为单位，无法在短时间内满足石油烃污染土壤的修复要求。微生物修复是在以小时(48～72 h)为单位的周期内的快速迭代和增殖过程中最大限度适应污染环境，将碳氢化合物的危险性通过吸收、降解、转化等作用减弱并最终分解为CO2和H2O的过程[32-33]，具备更高的修复效率和应用前景。本文从微生物的修复机理、典型菌种、环境影响因素以及目前研究热点等方面，系统地介绍了国内外现有生物修复石油烃污染土壤技术的研究现状，并对其研究发展方向进行了展望。
图1 土壤石油烃的修复过程
1 微生物修复技术分类
微生物修复技术按照工程应用中是否迁移土壤，可分为原位修复技术和异位修复技术。
1.1 原位微生物修复技术
原位微生物修复，又称为就地微生物修复，即不搬运污染土壤，采用直接向污染土壤中投加降解菌、营养物质、电子受体等方式进行的生物降解。该技术具有成本低、去除低浓度污染物的效率高等优点，但也存在修复时间长(数周)且修复效果具有高度的场地特异性等局限性，土壤的质地、组成、孔隙度和渗透性等场地特征对土壤修复效果有较大影响。该技术主要包括生物通风、生物强化和生物刺激三类。早期的原位修复技术也叫生物通风，主要是通过物理方式将大量空气输送至污染土壤，以促进微生物好氧降解。生物通风取决于空气在土壤中移动的能力，低气流就足以刺激到土壤微生物[34]。隋红等[35]通过模拟生物通风对甲苯的去除，发现较低通风速率便能够大大提高生物降解速率。生物通风技术工艺简单、操作方便，在去除土壤中易挥发污染物质的同时，还能促进部分大分子难挥发烃类物质的分解[36]，但单纯通风修复耗时较长，大量空气送入地下给原土壤理化结构和生物群落构成带来风险，并且由于地下水会干扰挥发污染物抽提外排过程，因此不适用于水分含量过高或距离地下水较近的污染地层。生物强化是向污染土壤投加外界通过筛选、培养及增殖等过程获得的高效降解菌剂，但在实际应用时，外源微生物会受到污染场地环境因素的影响，还可能与土著微生物之间出现竞争关系从而影响降解效果[37]。而生物刺激技术具有投资小、对土壤生态破坏小、能保持污染土壤中原有微生物群落的较高污染物降解活性[38]等优点，但是相关参数控制复杂并且需要针对不同污染区域的特点进行专门调整。关于生物强化和生物刺激在石油烃污染修复领域效果的强弱性一直争论不断，吴蔓莉等利用这两种方法分别去除土壤中TPH，最终生物刺激的降解率为28.3%，生物强化降解率为13.9%，由此得出生物刺激比生物强化更有效的结论[38]。但仅凭生物刺激又不足以修复缺乏本土石油降解剂的污染土壤，因此将二者有效结合在生物修复领域具有重要意义[37]。原位微生物修复技术分类及其优缺点见表1。
表1 原位微生物修复技术方法分类
1.2 异位微生物修复技术
将污染土壤先搬离原地，再对污染土壤集中进行微生物修复的技术被称为异位微生物修复技术。该技术的修复周期较短，且作业条件不可控因素少、工程化程度高，但也存在转移、运输和贮存等方面投资成本较大的不足。根据场地和设备的不同，主要包括预制床、农耕、堆肥处理以及生物反应器等方法，具体分类见表2。其中预制床法和生物反应器的修复方法高效，但因其单次处理量有限、设备维护复杂等不足[41]导致这两种技术主要停留在实验研究阶段，大规模应用研究较少。而农耕法是最接近原位修复的一种异位修复方法，可使一定深度内不同位置的石油烃污染土壤与空气充分接触，促进烃类物质挥发、氧化及分解，但当土壤中挥发性石油烃浓度较大时，土壤翻动过程会使大量无组织挥发性石油烃排放从而造成二次污染问题[42]，应用案例较少。堆肥处理通过向土壤中添加有机质，经过微生物的分解代谢将其转化为腐殖质，供微生物生长[43]。已经证明堆肥中的养分能促进细菌的生长，增加细菌群落的丰度和多样性[36,44]，从而提高烃类物质的降解效率，但过程中土壤氨态氮、硝态氮、有机氮等氮素损失较大。由于堆肥处理费用低廉且处理后的腐殖质还可作为肥料回归土壤，目前应用相对较多。
表2 异位生物修复技术方法分类
微生物修复是一个多因素共同作用的过程，每种方法有利有弊，不同修复技术间有区别也有联系，为进一步增强石油烃的去除效果，目前已出现多种原位(或异位)修复技术结合以及原位和异位修复技术相结合去除土壤石油烃的研究[36-46]，以解决使用单一方法时微生物活性低或者微生物培养困难等问题。
2 降解机理
微生物降解石油烃的过程主要是利用微生物体内的各种酶，通过氧化、水解、烷基化和去烷基化等代谢方式去除土壤石油烃，且烃类物质的结构越简单，越容易被降解[47-48]。其中，微生物加氧酶能够参与降解过程的第一步加羟基或后面的开环反应，在微生物降解石油烃类物质的过程中发挥重要作用[49-50]。一些微生物还能产生鼠李糖脂等生物表面活性剂，进一步促进烃类物质的解吸程度和生物利用率的提高[51]。一般而言，单一微生物往往只能降解少数特定烃类物质且降解能力有限[40]，如假单胞菌能够利用多种石油烃类组分，而不动杆菌对石油烃组分的降解能力依次为：烷烃 > 环烷烃 >芳烃，鞘氨醇单胞菌则被认为能高效降解多种芳香族化合物[52]。根据微生物的代谢过程不同，微生物对石油烃的降解主要分为好氧和厌氧过程。
好氧降解即在氧气充足的条件下，好氧和兼性好氧微生物将氧气作为电子受体、石油烃作为底物代谢的过程。该过程对烃类物质的C—C、C=C等化学键具有很强的断键能力[53]，且不同石油烃类物质的降解方式各不相同，如图2所示，链烷烃主要降解过程为单末端氧化、双末端氧化、β氧化和ω氧化等4种方式，烷烃羟化酶是催化降解烷烃第一步的关键酶[54-55]。环烷烃的降解是由2种氧化酶共同催化完成的，一种氧化酶先将其氧化为环醇，后形成环酮，接着另一种氧化酶再氧化环酮，环断开后进而降解[56]。而芳香烃是通过加氧酶的氧化作用形成邻苯二酚，再通过邻位或间位开环氧化[57-59]。目前降解石油烃的好氧型细菌有假单胞菌属(Pseudomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、变形杆菌属(Proteus)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、芽孢杆菌(Bacillus)及微球菌属(Micrococcus)等。研究最多的是假单胞菌，其降解烷烃及低环芳香烃的效果较好[60-61]。真菌包括假丝酵母属(Candida)、曲霉属(Aspergillum)、镰刀霉属(Fusarium)和短梗霉属(Aureobasidium)等，其中假丝酵母营养要求低，分解石油烃的同时还可生产酵母蛋白[62]，因此应用最多。常见放线菌有：链霉菌属(streptomyces)和诺卡氏菌属(Nocardia)等，但这类菌常降解不彻底[63]，如链霉菌会产生一些次生产物，例如聚酮类化合物如醌类、内酯等，以及生物碱、多肽等物质[64]。
图2 各种烃类的好氧降解过程
厌氧降解的最终产物以甲烷(50%)和二氧化碳(10%～20%)等气体为主，是在缺氧和无氧条件下，以硝酸盐、硫酸盐和碳酸盐等作为微生物呼吸的电子受体，石油烃为底物的代谢过程。一直以来，人们普遍认为石油烃降解多发生于好氧状态下，对于厌氧降解在石油烃修复领域研究较少。而自1991年首次报道了在厌氧条件下降解直链烷烃的硫酸盐还原菌[65]后，厌氧降解引起了关注。厌氧降解芳香烃主要通过甲基化和羧基化两种途径降解为苯甲酰辅酶A及间苯二酚、间苯三酚等中间产物，再在还原酶的作用下生成乙酰辅酶A和CO2[66]。目前厌氧菌包括发酵菌、硫酸盐还原菌和产甲烷菌等。其中发酵菌和硫酸盐还原菌是细菌和古菌的总称，前者能发酵糖、氨基酸、长链有机酸等复杂有机物，后者以硫酸盐为电子受体，能将硫酸盐、亚硫酸盐 、硫代硫酸盐以及元素硫等不同赋存形态的硫还原为硫化氢[67]；而产甲烷菌是一类生存条件极其厌氧的古细菌(Archea)，在地层油藏成油期就已存在[68]，但目前普遍认为产甲烷过程只能利用甲酸、甲醇、甲基胺类等一碳物质以及两碳物质中的乙酸为底物，反应速率较低[59]、生存条件苛刻且依赖互营代谢[69]。
3 影响因素
影响石油烃污染土壤的微生物修复的主要因素包括：温度、pH值、土壤含水率、氧气、营养物质、盐浓度以及石油烃浓度等(表3)。其中，温度是微生物维持自身正常代谢和内部酶活性的先决条件，也会对石油烃污染物质的物化性质产生影响。有研究表明，随着温度升高，微生物活性和石油烃溶解度均会随之提高，但当温度持续升高时，微生物内部大分子物质(如蛋白质、核酸)开始变性失去原有功能甚至导致死亡，而温度太低会抑制微生物体内酶的活性[70]。水是微生物与外界进行物质交换的必要媒介，当水分缺失时，不足以维持微生物正常的生长状态，而当水分过多时，会抑制细胞活性，导致降解速率降低，因此土壤含水率需要保持在25%～60%的范围之内，以确保氧气顺利在土壤孔隙中扩散和微生物活性的稳定[69]。微生物的降解过程在好氧和厌氧的状态下都能发生，但厌氧速率相对较慢，且厌氧降解产物的生态毒性高于好氧降解产物，并且链烷烃、烯烃等一些小分子物质在好氧条件下的降解效果更好[71]，因此石油烃污染土壤修复过程中一般尽可能保证氧分充足，以促进好氧菌降解能力的发挥。pH值会影响到土壤营养状况，还会影响到微生物对烃类物质的降解情况，一般生物降解的pH值多集中于中性环境下[72]。营养成分会直接影响到微生物对于烃类物质的降解情况，只有调整好微生物生长所需的各种营养元素的比例，才能保证生物降解工作的有效进行[73-75]。盐浓度会影响到土壤生物多样性及其生长过程，当盐分过高时，会破坏微生物的生理功能， 因此需要根据微生物的状态随时进行调节[76]。此外，石油烃类物质浓度对土壤中微生物的活性也具有显著影响，石油烃类是石油烃降解微生物的主要碳源，但若浓度过高会形成厚油层阻碍微生物对氧气和营养物质的吸收，还会毒害微生物[77-78]。各因素对石油降解菌发挥作用的影响不同，它们对石油微生物生长和繁殖及作用发挥的影响有一定的范围，在实际应用中需要因地制宜地确定石油烃污染土壤的修复条件及工艺参数。
表3 土壤修复效果的影响因素
4 耦合微生物修复技术
当石油烃浓度过高(w≥5%)时，不仅对微生物毒性较大[78]，且微生物降解后会残留一些高环芳香烃和沥青质等大分子物质[79]，因此出现多种耦合微生物修复技术的相关研究，即利用物理和化学法修复高浓度、难降解石油烃污染土壤的优势，采用各种形式与微生物修复技术进行耦合，为微生物修复的高效开展提供便利条件，同时减少物理和化学修复对土壤的影响。常见的耦合微生物技术包括植物+微生物、化学氧化+微生物、电动+微生物、表面活性剂+微生物以及固定化+微生物等技术。
4.1 植物耦合微生物修复技术
植物耦合微生物修复技术是利用植物和微生物之间存在的互惠互利关系进行石油烃污染土壤的修复。植物能够改善土壤环境，为微生物提供栖息地和营养，提高微生物分解代谢能力，而微生物能够分泌一些氨基酸、糖类等物质为植物生长提供碳源，同时还能够降低石油烃对植物的胁迫毒性，增强石油烃污染土壤整体修复效果。Kiamarsi Z等[80]研究发现，香根草(Vetiveria zizanioides (L.) Nash)对碳氢化合物具有较强的耐受性，在土壤石油烃污染程度为0～12%(质量分数)时，香根草对总石油烃(Total petroleum hydrocarbon,TPHs)的去除率为47%～77%，而利用香根草和降解菌则可使石油烃污染土壤的TPHs去除率提高到57.5%～84.6%，表明了该植物在有降解菌存在的情况下，可以更有效地净化石油烃污染土壤。此外，不仅长势良好的植物耦合微生物修复具有好的降解效果，利用植物秸秆吸附菌剂也可以增大微生物与石油的接触面积，显著提高菌剂对难降解烃类物质的降解率[81]。
4.2 化学氧化耦合微生物修复技术
石油烃污染土壤的微生物修复过程中，如遇大分子有机物(沥青质、胶质和多环芳烃等)，易造成微生物死亡，导致降解效率低，而化学氧化技术能将土壤中的难降解大分子物质转变为毒性较低的小分子物质，为生物修复提供电子受体[82]，因此诞生了化学氧化耦合微生物修复技术。目前常见的氧化剂有：过氧化氢[83]、过硫酸盐[84]、臭氧[85]、高锰酸盐[86]及Fenton试剂[87]等。其中臭氧因为本身就属于有毒物质，而高锰酸钾呈紫色会使得人们视觉上不适，还会生成二氧化锰沉淀，因此二者应用实例较少。过硫酸盐氧化是由于过硫酸盐可以形成强氧化性的硫酸盐自由基(SO4·-)(式(1))，再通过电子转移反应降解大部分有机污染物，从而形成以碳为中心的自由基(式(2))，再与有机中间体发生反应从而进一步降解[88]。而Fenton氧化是利用Fe催化H2O2生成Fe3+和具有较强的氧化电位羟基自由基(·OH)(式(3))，能够以非选择性的方式瞬间氧化有机污染物[89]。甄丽莎等[90]通过改性Fenton试剂强化微生物修复实验发现：TPHs去除率提高(4.73%～24.26%)，脱氢酶和多酚氧化酶活性增强，并且适当水平的芬顿试剂还可以简化种群间的关系、缓解种群间竞争。Gou等在缺氧条件下利用H2O2氧化和微生物联合处理多环芳烃污染陈年土壤时[83]，同样发现预氧化能促进细菌丰度的恢复，且能够有效强化多环芳烃的生物降解效果，再次说明化学氧化耦合微生物修复技术具有很大的降解潜力和降解优势。
S2O82-→2SO4·- (1)
SO4·-+CH3CO2-→SO42-+CH3CO2· (2)
Fe2++H2O2→Fe3++OH-+·OH (3)
4.3 电动耦合微生物修复技术
电动耦合微生物修复技术是通过电动作用为微生物提供电子受体、营养物质等，强化土壤物质的传递作用，增强生物活性，能够在不添加氧或电子受体的情况下促进污染物质氧化，从而达到较好的油污降解效果[91]。其中，电动修复取决于一系列电化学过程，包括电泳、电迁移和电渗透。赵敏等[92]利用电动耦合微生物技术降解污染土壤后石油烃降解率达90.02%，明显优于单纯电场或者单纯菌剂的修复效果(这二种技术的石油烃降解率分别为44.71%和65.81%)，说明总石油烃的降解率与电场强度呈正相关。郭书海等[6]也证明此结论，还发现微生物群落组成的变化主要取决于电场的持续时间[6]。马永松等[93]采用阴阳离子交换膜的电动微生物法对石油烃-重金属混合污染的土壤进行修复，亦证明上述结论，并且发现在低压状态下微生物能够降解烃类物质，且去除率与电压强度成正比，在高压状态下胶质和沥青质的去除以电渗流的迁移作用为主。以上研究均表明生物降解和电化学刺激之间存在协同效应。
4.4 表面活性剂耦合微生物修复技术
该技术是利用表面活性剂降低油滴运动和解吸阻力，增加土壤孔隙中石油烃的溶解度，从而提高微生物降解土壤石油烃的效率[94]。利用混合表面活性剂(SDBS-Tween80)耦合微生物技术修复DDTs-PAHs复合污染的农田土壤[95]，研究发现表面活性剂耦合微生物修复处理的DDTs和PAHs降解率分别可达57.8%和35.6%，较单独接菌的对照组分别提高了14.9%和11.9%，表明表面活性剂耦合微生物修复技术在降解土壤石油烃方面具有一定的可行性。目前市场上的表面活性剂有非离子型、阴离子型、阳离子型以及生物表面活性剂。生物表面活性剂因其绿色环保的性质，应用越来越广，研究最多的是鼠李糖脂，罗志刚等[96]发现鼠李糖脂对部分革兰氏菌和真菌均具有明显的抑菌作用，但目前制约其发展的因素是成本高和纯度低。
4.5 固定化微生物修复技术
固定化微生物技术是通过吸附、交联、共价键和包埋等方法，将游离的微生物或酶固定在特定载体空间内，以保持微生物活性[97]。该法具有生物负荷高、环境耐受性强、生物稳定性高、储存和使用方便等优点。目前固定化载体材料大多为农业废弃物，如稻秆、花生壳、海藻酸钠、生物炭等，这些物质具有很好的传氧、持水和提高酶活性的能力。Zhang等[15]以未添加生物炭和细菌的土壤作为对照，发现固定于生物炭的细菌处理、生物炭-游离细菌处理、单独细菌处理和单独生物炭处理的TPHs去除率分别为58.08%、45.31%、38.63%和29.85%，而对照组的去除率仅为8.69%，表明生物炭固定化微生物处理对污染土壤的适应性较强，能够显著提升石油烃的生物降解效果；Guo等[98]发现麦麸生物炭固定4种组合细菌处理对土壤的总石油烃去除率(58.31%)均高于其单独细菌组合处理(43.98%)和单独生物炭组合处理(36.91%)，且使用生物炭和固定化材料降解石油烃污染土壤不仅能够增强生物降解效果，还能减少温室气体排放，充分说明固定化微生物技术具有很大的发展潜力，且该技术在降解石油烃-重金属复合污染土壤方面也具有潜在的有效性[99]。
5 展 望
(1)微生物修复石油烃污染土壤的石油烃浓度大多在2%～10%(质量分数)的范围内，最适宜的降解石油烃浓度范围在4%左右。根据《废矿物油回收利用污染控制技术规范》(HJ 607-2011)的相关要求“含油率大于5%的含油污泥、油泥沙应进行再生利用”，基于促进产学研结合和响应国家节能增效减排大政方针的目的，针对含油率≥5%的石油烃污染土壤所开展的相关修复研究，应以尽可能资源化为突破口，在石油烃资源回收技术研究成果的基础上，充分开展高效好氧微生物或耦合微生物修复技术针对低浓度(≤5%)石油烃污染的相关研究。
(2)随着耦合微生物技术研究和应用的不断深入，微生物降解土壤石油烃污染的难度也大大降低，使微生物原位修复效率日渐提高的同时，避免了异位修复过程中危险废物转移带来的一系列二次污染风险、政策风险和成本问题。《中华人民共和国土壤污染防治法》(2018版)中规定的修复活动不得对土壤和周边环境造成新的污染，《土壤环境质量建设用地土壤污染风险管控标准(试行)》(GB 36600—2018)中规定一类建设用地中石油烃含量不得超过826 mg/kg，二类用地不得超过4 500 mg/kg，因此，在修复前必须对污染场地进行风险评估，确定风险等级后再依次开展修复工作，并且未来应主要围绕原位修复技术开展多种耦合微生物修复技术的规律、机理及应用研究。
(3)目前研究大多集中于如何利用微生物降解去除石油烃污染物，其过程主要为好氧代谢，产生大量二氧化碳气体，而对如何利用微生物回收利用低浓度(≤5%)石油烃污染物的报道较少。在我国“十四五”规划环境保护工作的重点以“双碳”(碳达峰、碳中和)为目标的背景下，应针对性地开发低浓度石油烃污染的能源回收和减排型修复技术，如通过开展高效厌氧微生物石油烃污染土壤修复技术的研究，以甲烷的形式回收石油烃类物质，或寻找可能存在的好氧型高效产甲烷微生物并围绕该类微生物开展相关应用及机理研究。
